Škálování fermentace: Komplexní průvodce pro globální biotechnologický pokrok

Fermentace, metabolický proces, který přeměňuje cukry na kyseliny, plyny nebo alkohol, je základem různých průmyslových odvětví, včetně potravinářství a nápojů, farmaceutického průmyslu, biopaliv a průmyslových enzymů. Škálování fermentačních procesů, přechod z laboratorního měřítka na průmyslové výrobní měřítko, představuje významné výzvy a vyžaduje hluboké pochopení principů procesního inženýrství. Tento průvodce poskytuje komplexní přehled škálování fermentace, pokrývající klíčové koncepty, výzvy, technologie a strategie pro úspěšnou optimalizaci bioprocesů napříč různými odvětvími po celém světě.

Proč je škálování fermentace důležité?

Schopnost efektivně škálovat fermentační procesy je klíčová pro komercializaci biotechnologických inovací. Zatímco slibné výsledky mohou být dosaženy v laboratorním měřítku, přenos těchto výsledků do velkovýroby vyžaduje pečlivé zvážení různých faktorů, včetně:

• Udržení výkonnosti procesu: Zajištění, že se při zvyšování měřítka udržuje požadovaný výtěžek produktu, kvalita a produktivita.
• Nákladová efektivita: Optimalizace procesu pro minimalizaci výrobních nákladů a maximalizaci ziskovosti.
• Soulad s předpisy: Splnění přísných regulačních požadavků na bezpečnost a účinnost produktů na různých globálních trzích.
• Splnění poptávky trhu: Produkce dostatečného množství produktu k uspokojení poptávky trhu.

Úspěšné zvládnutí složitostí škálování fermentace je nezbytné pro společnosti, které chtějí komercializovat své biotechnologické produkty a získat konkurenční výhodu na globálním trhu. Například farmaceutická společnost vyvíjející nový antibiotikum prostřednictvím mikrobiální fermentace potřebuje zajistit, aby fermentační proces mohl být škálován pro výrobu léku v dostatečném množství, aby uspokojil potřeby pacientů po celém světě. Podobně společnost zabývající se biopalivy, která se snaží vyrábět ethanol z lignocelulózové biomasy, musí optimalizovat fermentační proces pro velkovýrobu, aby biopaliva učinila životaschopnou alternativou k fosilním palivům.

Klíčové principy škálování fermentace

Úspěšné škálování fermentace se opírá o několik základních principů procesního inženýrství. Pochopení a aplikace těchto principů je klíčové pro dosažení optimálního výkonu procesu v průmyslovém měřítku.

1. Udržení konstantního objemového koeficientu přenosu hmoty (kLa)

Přenos kyslíku je často omezujícím faktorem v aerobních fermentačních procesech. Objemový koeficient přenosu hmoty (kLa) je klíčovým parametrem, který popisuje rychlost přenosu kyslíku z plynné fáze do kapalné fáze v bioreaktoru. Udržení konstantního kLa během škálování je nezbytné pro zajištění toho, aby buňky dostávaly dostatek kyslíku pro růst a tvorbu produktu. Toho lze dosáhnout úpravou parametrů, jako je rychlost míchání, rychlost provzdušňování a geometrie bioreaktoru.

Například při výrobě kyseliny citronové pomocí Aspergillus niger může omezení kyslíku významně snížit výtěžek kyseliny citronové. Udržení dostatečného kLa během celého fermentačního procesu je klíčové pro maximalizaci produkce kyseliny citronové. K vylepšení přenosu kyslíku lze použít různé strategie, jako je použití vzduchu obohaceného kyslíkem nebo optimalizace návrhu oběžného kola.

2. Udržení konstantní doby míchání

Efektivní míchání je klíčové pro zajištění homogeneity v bioreaktoru, zabránění omezení substrátem nebo živinami a rozptýlení tepla. Udržení konstantní doby míchání během škálování je důležité pro zajištění toho, aby buňky zažívaly jednotné prostředí a aby se minimalizovaly gradienty živin, pH a teploty. Doba míchání může být ovlivněna faktory, jako je návrh oběžného kola, rychlost oběžného kola a geometrie bioreaktoru.

Zvažte výrobu rekombinantních proteinů v kultivaci savčích buněk. Savčí buňky jsou citlivé na střih a nadměrné míchání může poškodit buňky a snížit výtěžek proteinu. Nedostatečné míchání však může vést k omezení živin a shlukování buněk. Optimalizace doby míchání k vyvážení těchto protichůdných faktorů je klíčová pro úspěšné škálování.

3. Udržení konstantní rychlosti střihu

Rychlost střihu, rychlost, při které se sousední vrstvy tekutiny pohybují relativně k sobě, může mít významný vliv na životaschopnost buněk a kvalitu produktu, zejména u buněk citlivých na střih, jako jsou savčí buňky a rostlinné buňky. Udržení konstantní rychlosti střihu během škálování je důležité pro minimalizaci poškození buněk a zajištění konzistentní kvality produktu. Rychlost střihu lze kontrolovat úpravou parametrů, jako je rychlost oběžného kola a návrh oběžného kola.

Například při výrobě monoklonálních protilátek v buňkách CHO může nadměrný střihový stres vést k lýze buněk a uvolnění intracelulárních proteáz, které mohou degradovat protilátky. Použití oběžných kol s nízkým střihem a optimalizace rychlosti míchání může pomoci minimalizovat střihový stres a zlepšit produkci protilátek.

4. Udržení konstantního příkonu na jednotku objemu (P/V)

Příkon na jednotku objemu (P/V) je mírou dodávání energie do bioreaktoru pro míchání a provzdušňování. Udržení konstantního P/V během škálování může pomoci zajistit, aby charakteristiky míchání a přenosu kyslíku bioreaktoru byly na různých měřítkách podobné. Je však důležité poznamenat, že P/V není jediným faktorem, který ovlivňuje míchání a přenos kyslíku, a měly by být zváženy i další parametry, jako je návrh oběžného kola a geometrie bioreaktoru.

V mnoha bakteriálních fermentacích může být vyšší P/V přijatelnější kvůli robustnější povaze bakteriálních buněk ve srovnání se savčími buňkami. Avšak i u bakteriálních fermentací může nadměrné P/V vést ke zvýšené spotřebě energie a v některých případech potenciálně k poškození buněk. Optimalizace P/V ve spojení s dalšími parametry je proto klíčová.

5. Geometrická podobnost

Udržení geometrické podobnosti během škálování znamená, že poměry rozměrů bioreaktoru (např. průměr, výška, průměr oběžného kola) zůstávají konstantní. To může pomoci zajistit, že tokové vzorce a charakteristiky míchání bioreaktoru jsou na různých měřítkách podobné. Není však často možné udržet dokonalou geometrickou podobnost kvůli praktickým omezením, jako jsou náklady a prostorová omezení. Navíc dokonalá geometrická podobnost nezaručuje identický výkon, protože tekutinovou dynamiku nediktují pouze geometrie.

Například geometricky podobné bioreaktory mohou mít různé poměry povrchu k objemu, což může ovlivnit přenos tepla a rychlost odpařování. Modelování výpočetní dynamiky tekutin (CFD) lze použít k posouzení dopadu odchylek od geometrické podobnosti na výkon bioreaktoru.

Výzvy při škálování fermentace

Škálování fermentačních procesů představuje řadu výzev, které vyžadují pečlivé zvážení různých faktorů, které mohou ovlivnit výkon procesu.

1. Omezení přenosu kyslíku

S rostoucím měřítkem bioreaktoru je obtížnější udržovat dostatečný přenos kyslíku do buněk. Je to proto, že se snižuje poměr povrchu k objemu a zvětšuje se difuzní dráha kyslíku. Omezení kyslíku může vést ke snížení růstu buněk, tvorbě produktu a dokonce k úhynu buněk.

Řešení:

• Zvýšit rychlost provzdušňování.
• Zvýšit rychlost míchání.
• Použít vzduch obohacený kyslíkem nebo čistý kyslík.
• Optimalizovat návrh oběžného kola.
• Použít bioreaktor s větším poměrem povrchu k objemu.
• Implementovat strategie, jako je použití mikrobublin nebo membránového provzdušňování.

2. Odvod tepla

Fermentační procesy generují teplo v důsledku metabolické aktivity a míchání. S rostoucím měřítkem bioreaktoru je obtížnější toto teplo odvádět, což může vést ke zvýšení teploty a snížení růstu buněk a tvorby produktu. Udržování optimální teploty je klíčové pro aktivitu enzymů a celkové zdraví buněk.

Řešení:

• Použít bioreaktor s chladicím pláštěm nebo vnitřními chladicími hady.
• Zvýšit průtok chladicí kapaliny.
• Použít účinnější chladicí systém.
• Optimalizovat fermentační proces pro snížení produkce tepla.
• Zvážit odpařovací chlazení, pokud je to vhodné (a pokud ztráta těkavých produktů není problém).

3. Nehomogenity míchání

S rostoucím měřítkem bioreaktoru je obtížnější udržovat jednotné míchání v celém zařízení. To může vést ke gradientům živin, pH a teploty, které mohou negativně ovlivnit růst buněk a tvorbu produktu. Mrtvé zóny nebo špatně promíchané oblasti mohou také podporovat akumulaci toxických vedlejších produktů.

Řešení:

• Optimalizovat návrh oběžného kola.
• Zvýšit rychlost míchání.
• Použít více oběžných kol.
• Optimalizovat geometrii bioreaktoru.
• Použít modelování CFD k pochopení a optimalizaci vzorců míchání.

4. Kontrola pH

Udržení optimálního pH je klíčové pro růst buněk a tvorbu produktu. S rostoucím měřítkem bioreaktoru je obtížnější udržovat jednotné pH v celém zařízení. To může vést ke gradientům pH, které mohou negativně ovlivnit růst buněk a tvorbu produktu. Metabolické vedlejší produkty mohou významně měnit pH, což vyžaduje přísnou kontrolu.

Řešení:

• Použít systém řízení pH s přidáváním kyselin a zásad.
• Optimalizovat umístění sondy pH a bodů přidávání kyselin/zásad.
• Použít pufr k udržení stabilního pH.
• Zvážit použití online systému pro monitorování a řízení pH.

5. Kontrola pěny

Tvorba pěny je běžným problémem ve fermentačních procesech, zejména těch, které zahrnují proteiny nebo povrchově aktivní látky. Pěna může vést ke snížení pracovního objemu, kontaminaci a ucpávání senzorů a filtrů. Také ztěžuje přenos kyslíku.

Řešení:

• Přidat protipěnové prostředky.
• Optimalizovat rychlosti míchání a provzdušňování.
• Použít mechanický rozbíječ pěny.
• Zvážit použití senzoru pěny k automatickému přidávání protipěnových prostředků.

6. Změny morfologie nebo fyziologie

Buňky mohou vykazovat změněnou morfologii nebo fyziologii se zvyšujícím se měřítkem. Střihový stres nebo jiné změny v prostředí bioreaktoru mohou způsobit, že buňky produkují různé proteiny nebo mají různou rychlost růstu. Tyto změny mohou ovlivnit výtěžek produktu a kvalitu. To je zvláště rozšířené u vláknitých organismů nebo agregovaných buněčných kultur.

Řešení:

• Pečlivě monitorovat buněčnou morfologii a fyziologii během škálování.
• Upravit parametry fermentace (např. teplota, pH, hladiny živin) pro udržení optimálního růstu buněk a tvorby produktu.
• Zvážit použití rozšiřovacího cyklu (seed train) k postupné adaptaci buněk na prostředí většího měřítka.
• Použít procesní analytickou technologii (PAT) k monitorování kritických procesních parametrů v reálném čase.

7. Udržení sterility

Udržení sterility je klíčové pro prevenci kontaminace a zajištění kvality produktu. S rostoucím měřítkem bioreaktoru je obtížnější udržovat sterilitu kvůli zvětšenému povrchu a zvýšenému počtu spojení a odběrných míst.

Řešení:

• Použít validované sterilizační postupy pro veškeré vybavení a média.
• Implementovat přísné aseptické techniky během provozu.
• Použít sterilní filtry pro proudy vzduchu a plynů.
• Pravidelně monitorovat bioreaktor na kontaminaci.
• Zajistit správné utěsnění všech spojení a portů.

Technologie pro škálování fermentace

Existuje několik technologií, které pomáhají při škálování a optimalizaci fermentace. Tyto technologie mohou pomoci překonat výzvy spojené se škálováním fermentačních procesů a zlepšit výkon procesu.

1. Výpočetní dynamika tekutin (CFD)

CFD je výkonný nástroj pro simulaci proudění tekutin, přenosu tepla a přenosu hmoty v bioreaktorech. CFD lze použít k optimalizaci návrhu bioreaktoru, předpovídání vzorců míchání a identifikaci mrtvých zón. Modelování CFD může pomoci předpovědět podmínky ve větších měřítkách na základě experimentů v malém měřítku, čímž se sníží počet nákladných pilotních běhů.

Příklad: CFD lze použít k optimalizaci návrhu a umístění oběžného kola ve velkém bioreaktoru k zajištění jednotného míchání a přenosu kyslíku. Může také identifikovat oblasti s vysokým střihem, což umožňuje inženýrům upravit návrh tak, aby se minimalizovalo poškození buněk.

2. Procesní analytická technologie (PAT)

PAT je systém pro návrh, analýzu a řízení výroby prostřednictvím včasných měření (tj. během zpracování) klíčových atributů kvality a atributů výkonnosti surovin a procesů ve výrobě s cílem zajistit kvalitu konečného produktu. Nástroje PAT zahrnují senzory pro monitorování pH, teploty, rozpuštěného kyslíku, hustoty buněk a hladin živin. Sběr dat v reálném čase umožňuje okamžité úpravy fermentačního procesu, což vede ke zvýšení účinnosti a reprodukovatelnosti.

Příklad: Použití online spektrometru blízké infračervené oblasti (NIR) k monitorování hladin glukózy ve fermentační bředě umožňuje úpravy rychlosti podávání v reálném čase, čímž se zabrání omezení glukózy nebo nadměrnému podávání, které obojí může negativně ovlivnit výtěžek produktu.

3. Statistický návrh experimentů (DoE)

DoE je systematický přístup k plánování a provádění experimentů za účelem identifikace optimálních provozních podmínek pro proces. DoE lze použít k optimalizaci fermentačních parametrů, jako je teplota, pH, hladiny živin a rychlost provzdušňování. DoE je mnohem efektivnější přístup než tradiční experimentování „jeden faktor v jednom okamžiku“.

Příklad: Použití DoE k optimalizaci koncentrací různých živin ve fermentačním médiu může významně zlepšit výtěžek produktu. Statistický přístup umožňuje identifikovat interakce mezi živinami, které by nemusely být patrné při tradičním experimentování.

4. Pokročilé návrhy bioreaktorů

Bylo vyvinuto několik pokročilých návrhů bioreaktorů pro zlepšení výkonu procesu. Mezi ně patří:

• Vzduchové bioreaktory: Tyto bioreaktory používají vzduch k zajištění míchání a přenosu kyslíku. Jsou zvláště užitečné pro buňky citlivé na střih.
• Membránové bioreaktory: Tyto bioreaktory používají membrány k oddělení buněk od fermentační bředě, což umožňuje vysoké buněčné hustoty a kontinuální odstraňování produktu.
• Vlnové bioreaktory: Tyto bioreaktory používají kolébavý pohyb k zajištění míchání a provzdušňování. Jsou zvláště užitečné pro aplikace buněčných kultur.
• Jednorázové bioreaktory: Tyto bioreaktory jsou předsterilizované a jednorázové, což eliminuje potřebu čištění a sterilizace a snižuje riziko kontaminace.

Příklad: Jednorázové bioreaktory jsou stále častěji používány v biofarmaceutickém průmyslu pro výrobu monoklonálních protilátek. Tyto bioreaktory nabízejí několik výhod, včetně snížených kapitálových nákladů, rychlejší doby odezvy a nižšího rizika kontaminace.

5. Modely zmenšeného měřítka

Modely zmenšeného měřítka jsou malé bioreaktory, které jsou navrženy tak, aby napodobovaly podmínky ve velkém bioreaktoru. Modely zmenšeného měřítka lze použít ke studiu vlivu různých procesních parametrů na růst buněk a tvorbu produktu, bez nutnosti provádět experimenty ve velkém bioreaktoru. Tím se šetří čas a zdroje.

Příklad: Model zmenšeného měřítka lze použít k simulaci omezení přenosu kyslíku ve velkém bioreaktoru. Studiem vlivu omezení kyslíku na růst buněk a tvorbu produktu v modelu zmenšeného měřítka mohou inženýři vyvinout strategie k překonání těchto omezení ve velkém bioreaktoru.

Strategie pro úspěšné škálování fermentace

Úspěšné škálování fermentace vyžaduje dobře naplánovanou a provedenou strategii, která řeší výzvy a využívá dostupné technologie.

1. Důkladné pochopení procesu

Hluboké pochopení fermentačního procesu je nezbytné pro úspěšné škálování. To zahrnuje pochopení metabolických drah, optimálních růstových podmínek pro buňky a kritických procesních parametrů, které ovlivňují výtěžek produktu a kvalitu. Pochopení potenciálních inhibičních faktorů je také klíčové. Pevný základ postavený na dobře charakterizovaných experimentech v malém měřítku je nezbytný.

2. Vyvinout robustní rozšiřovací cyklus (Seed Train)

Robustní rozšiřovací cyklus je klíčový pro zajištění toho, aby buňky byly zdravé a aktivně rostly, když jsou přeneseny do velkého bioreaktoru. Rozšiřovací cyklus by měl být navržen tak, aby postupně adaptoval buňky na prostředí většího měřítka. To často zahrnuje začátek s malým inokulem v erlenmeyerově baňce a postupné zvyšování objemu inokula prostřednictvím série postupně větších bioreaktorů.

3. Implementovat přístup vhodný pro danou fázi

Přístup vhodný pro danou fázi znamená, že úroveň přísnosti a dokumentace by měla odpovídat fázi vývoje. Raná fáze vývoje procesu se může soustředit na identifikaci optimálních fermentačních parametrů, zatímco pozdější fáze vývoje procesu by se měla soustředit na optimalizaci a validaci procesu, aby se zajistila konzistentní kvalita produktu a reprodukovatelnost.

4. Provést pilotní studie

Pilotní studie jsou nezbytným krokem v procesu škálování. Pilotní studie vám umožní otestovat fermentační proces v bioreaktoru, který je velikostí bližší velkého bioreaktoru. To vám umožní identifikovat potenciální problémy a optimalizovat proces před přechodem na plnohodnotnou výrobu. Pilotní studie mohou odhalit problémy s mícháním, přenosem tepla nebo řízením pH, které nebyly patrné v menším měřítku.

5. Monitorovat kritické procesní parametry

Kontinuální monitorování kritických procesních parametrů (CPP) je nezbytné pro zajištění konzistentní kvality produktu a reprodukovatelnosti. Mezi CPP patří teplota, pH, rozpuštěný kyslík, hustota buněk a hladiny živin. Monitorování v reálném čase umožňuje okamžité úpravy fermentačního procesu, čímž se zabrání odchylkám od optimálních provozních podmínek.

6. Implementovat strategie řízení procesu

Strategie řízení procesu jsou nezbytné pro udržení fermentačního procesu v požadovaném provozním rozsahu. To zahrnuje implementaci zpětnovazebních řídicích smyček pro automatické úpravy parametrů, jako je teplota, pH a rozpuštěný kyslík. Pokročilé řídicí strategie, jako je prediktivní řízení založené na modelu (MPC), lze použít k optimalizaci fermentačního procesu v reálném čase.

7. Vyvinout důkladný protokol čištění a sterilizace

Důkladný protokol čištění a sterilizace je nezbytný pro prevenci kontaminace a zajištění kvality produktu. Protokol by měl obsahovat podrobné postupy pro čištění a sterilizaci veškerého vybavení a médií. Účinnost protokolu čištění a sterilizace by měla být validována, aby se zajistilo, že dokáže odstranit všechny kontaminanty.

8. Dokumentace a sledovatelnost

Podrobná dokumentace je klíčová pro prokázání, že fermentační proces je dobře řízen a že produkt splňuje všechny požadavky na kvalitu. To zahrnuje dokumentování všech procesních parametrů, surovin a výsledků analýz. Měl by být veden komplexní auditní záznam pro zajištění sledovatelnosti všech dat.

Globální případové studie škálování fermentace

Zkoumání úspěšných příběhů škálování fermentace z celého světa nabízí cenné poznatky a naučené lekce.

1. Produkce inzulínu v Dánsku

Novo Nordisk, dánská farmaceutická společnost, je světovým lídrem ve výrobě inzulínu. Společnost úspěšně škálovala své fermentační procesy pro výrobu rekombinantního inzulínu v Saccharomyces cerevisiae. Klíčem k jejich úspěchu bylo zavedení pokročilých strategií řízení procesu a použití jednorázových bioreaktorů. Rovněž využívají pokročilé techniky následného zpracování k čištění inzulínu, aby splnili přísné regulační požadavky po celém světě.

2. Produkce biopaliv v Brazílii

Brazílie je světovým lídrem ve výrobě etanolu z cukrové třtiny. Brazilské společnosti vyvinuly vysoce účinné fermentační procesy pro výrobu etanolu, který se používá jako biopalivo. Škálování těchto procesů zahrnovalo optimalizaci kmenů kvasinek používaných pro fermentaci, zlepšení účinnosti fermentačního procesu a vývoj robustních technik následného zpracování. Běžně se používá kontinuální fermentace.

3. Produkce antibiotik v Indii

Indie je významným výrobcem antibiotik. Indické farmaceutické společnosti úspěšně škálovaly své fermentační procesy pro výrobu různých antibiotik, včetně penicilinu a cefalosporinů. To zahrnovalo optimalizaci fermentačních podmínek, zlepšení účinnosti fermentačního procesu a vývoj robustních technik následného zpracování. Zaměřili se také na nákladově efektivní výrobní strategie, aby mohli konkurovat na globálním trhu.

4. Produkce průmyslových enzymů v Číně

Čína je významným výrobcem průmyslových enzymů. Čínské společnosti škálovaly své fermentační procesy pro výrobu různých enzymů, včetně amyláz, proteáz a lipáz. Tyto enzymy se používají v široké škále průmyslových odvětví, včetně potravinářství a nápojů, textilu a čisticích prostředků. Běžnou praxí je efektivní velkovýroba fermentace pomocí geneticky modifikovaných organismů (GMO). Mezi výzvy patří řešení rozmanitosti surovin a udržování kontroly kvality.

Budoucnost škálování fermentace

Oblast škálování fermentace se neustále vyvíjí, s novými technologiemi a strategiemi vyvíjenými pro zlepšení výkonu procesu a snížení nákladů. Mezi klíčové trendy ve škálování fermentace patří:

• Zvýšené využití automatizace a robotiky: Automatizace a robotika mohou pomoci zlepšit účinnost a reprodukovatelnost fermentačních procesů.
• Vývoj účinnějších návrhů bioreaktorů: Vyvíjejí se nové návrhy bioreaktorů pro zlepšení míchání, přenosu kyslíku a přenosu tepla.
• Zvýšené využití procesní analytické technologie (PAT): PAT může pomoci monitorovat kritické procesní parametry v reálném čase, což umožňuje okamžité úpravy fermentačního procesu.
• Integrace datové analýzy a umělé inteligence (AI): Datová analýza a AI lze použít k optimalizaci fermentačních procesů a předpovědi výkonu procesu.
• Důraz na udržitelnost: Společnosti se stále více zaměřují na vývoj udržitelných fermentačních procesů, které minimalizují odpad a spotřebu energie.

Závěr

Škálování fermentace je složitý a náročný proces, ale je nezbytný pro komercializaci biotechnologických inovací. Pochopením klíčových principů škálování fermentace, řešením výzev, využíváním dostupných technologií a implementací dobře naplánované strategie mohou společnosti úspěšně škálovat své fermentační procesy a získat konkurenční výhodu na globálním trhu. Neustálé inovace a zaměření na udržitelnost budou klíčové pro budoucnost fermentačních technologií po celém světě.